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(NY/T541-2002)

1 范围

本标准规定了动物疫病诊断实验室的样品采集方法。???

本标准适用于病因()学、病理组织学、血清学、免疫学等实验室检验所需样品的采集。

2 样品①采集的一般原则和采集前的准备

2.1 样品采集所遵循的一般原则

2.1.1 凡发现患畜(包括马、牛、羊及猪等)有急性死亡时,如怀疑是炭疽,则不可随意解剖,应采取患畜的血液,万不得已时局部解剖作脾脏触片的显微镜检查。只有在确定不是炭疽后,方可进行剖检。

2.1.2 采取病料的种类,根据不同的疾病或检验目的,采其相应的脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料;进行流行病学调查、抗体检测、动物群体健康评估或环境卫生检测时,样品的数量应满足统计学的要求。采样时应/jxjD,.谨慎,以免对动物产生不必要的刺激或损害和对采样者构成威胁。在无法估计病因时,可进行全面的采集。检查病变与采集病料应统筹考虑。

2.1.3 内肌病料的采取,如患畜已死亡,应尽快采集,最迟不超过6h

2.1.4 血液样品在采集前一般禁食8h

2.1.5 应做好人身防护,严防人畜共患病感染。

2.1.6 应防止污染环境,防止疫病传播,做好环境消毒和病害肉尸的处理。

2.2 使用器械的消毒

刀、剪、镊子等用具煮沸消毒30min,使用前用酒精擦拭,用时进行火焰消毒。器皿(玻制、陶制等)103kPa高压30min,或经160C干烤2h灭菌;或放于05%一1%的碳酸氢钠(NaHCr~)水中煮沸10min? 15rain,水洗后,再用清洁纱布擦干,保存于酒精、乙醚等溶液中备用。注射器和针头放于清洁水中煮沸30rain。一般要求使用“一次性”针头和注射器。采取一种病料,使用一套器械与容器,不可用其再采其他病料或容纳其他脏器材料。采过病料的用具应先消毒后清洗。检查过传染性海绵状脑病的器械要放在2molL的氢氧化钠(NaOH)溶液中浸泡2h以上,才可再使用。

3 样品的采集

3.1 血液

3.1.1 采血部位

大的哺乳动物可选用颈静脉或尾静脉采血,也可采胫外静脉和乳房静脉血。毛皮动物小量采血可穿刺耳尖或耳壳外侧静脉,多量采血可在隐静脉采集,也可用尖刀划破趾垫0.5cm深或剪断尾尖部采血。啮齿类动物可从尾尖采血,也可由眼窝内的血管丛采血;兔可从耳背静脉、颈静脉或心脏采血。禽类通常选择翅静脉采血,也可通过心脏采血。

3.1.2 采血方法

对动物采血部位的皮肤先剃毛(拔毛)75%的酒精消毒,待干燥后采血,采血可用针管、针头、真空管或用三棱针穿刺,将血液滴到开口的试管内。禽类等的少量血清样品的采集,可用塑料管采集。用针头刺破消毒过的翅静脉,将血液滴到直径为3mm4mm的塑料管内,将一端封口。

3.1.3 采血种类

3.1.3.1 全血样品

进行血液学分析,细菌、病毒或原虫培养,通常用全血样品,样品中加抗凝剂。抗凝剂可用0.1%肝素、阿氏液(见第A.1)(阿氏液为红细胞保存液,使用时,以1份血液加2份阿氏液),或枸橼酸钠(3.8%一4%的枸橼酸钠0.1mL,可抗1mL血液)。采血时应直接将血液滴人抗凝剂中,并立即连续摇动,充分混合。也可将血液放人装有玻璃珠的灭菌瓶内,震荡脱纤维蛋白。

3.1.3.2 血清样品

进行血清学试验通常用血清样品。用作血清样品的血液中不加抗凝剂,血液在室温下静置2h~4h(防止曝晒),待血液凝固,有血清析出时,用无菌剥离针剥离血凝块,然后置4℃冰箱过夜,待大部分血清析出后取出血清,必要时经低速离心分离出血清。在不影响检验要求原则下可因需要加入适宜的防腐剂。做病毒中和试验的血清避免使用化学防腐剂(如硼酸、硫柳汞等)。若需长时间保存,则将血清置20C以下保存,但要尽量防止或减少反复冻融。样品容器上贴详细标签。

3.1.3.3 血浆的采集

采血试管内先加上抗凝剂(10mL血加柠檬酸钠004g005g),血液采完后,将试管颠倒几次,使血液与抗凝剂充分混合,然后静止,待细胞下沉后,上层即为血浆。

3.2  一般组织

3.2.1 采样方法

用常规解剖器械剥离死亡动物的皮肤,体腔用消毒的器械剥开,所需病料按无菌操作方法从新鲜尸体中采集。剖开腹腔后,注意不要损坏肠道。

作病原分离用:进行细菌、病毒、原虫等病原分离所用组织块的采集,可用一套新消毒的器械切取所需器官的组织块,每个组织块应单独放在已消毒的容器内,容器壁上注明日期、组织或动物名称。注意防止组织间相互污染。

3.2.2 采样种类

3.2.2.1 病原分离样品的采集

用于微生物学检验的病料应新鲜,尽可能的减少污染。用于细菌分离的样品的采集,首先以烧红的刀片烫烙脏器表面,在烧烙部位刺一孔,用灭菌后的铂耳伸人孔内,取少量组织或液体,作涂片镜检或划线接种于适宜的培养基上。

3.2.2.2 组织病理学检查样品的采集

采集包括病灶及临近正常组织的组织块,立即放人10倍于组织块的10%福尔马林溶液中固定。组织块厚度不超过05cm,切成1cm22cm2(检查狂犬病则需要较大的组织块)。组织块切忌挤压、刮摸和用水洗。如作冷冻切片用,则将组织块放在012412容器中,尽快送实验室检验。

3.3 肠内容物或粪便

肠道只需选择病变最明显的部分,将其中的内容物弃去,用灭菌生理盐水轻轻冲洗;也可烧烙肠壁表面,用吸管扎穿肠壁,从肠腔内吸取内容物,将肠内容物放人盛有灭菌的30%甘油盐水缓冲保存液(见第A2)中送检。或者,将带有粪便的肠管两端结扎,从两端剪断送检。

从体外采集粪便,应力求新鲜。或者,用拭子小心地插到直肠粘膜表面采集粪便,然后将拭子放人盛有灭菌的30%甘油盐水缓冲保存液中送检。

3.4 胃液及瘤胃内容物

3.4.1 胃液采集

胃液可用多孔的胃管抽取。将胃管送入胃内,其外露端接在吸引器的负压瓶上,加负压后,胃液即可自动流出。

3.4.2 瘤胃内容物采集

反刍动物在反刍时,与食团从食道逆人口腔时,立即开口拉住舌头,另一只手深入口腔即可取出少量的瘤胃内容物。

3.5 呼吸道

应用灭菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉或气管内的分泌物,蘸取分泌物后立即将

拭子浸入保存液中,密封低温保存。常用的保存液有pH7.27.4的灭菌肉汤(见第A3)或磷酸盐缓冲盐水,如准备将待检标本接种组织培养,则保存于含05%乳蛋白水解物的汉克氏(Hanks)液中。一般每支拭子需保存液5mL

3.6 生殖道

可采集阴道或包皮冲洗液,或者采用合适的拭子,有时也可用尿道拭子采集。

3.7 眼睛

眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后,放在灭菌的30%甘油盐水缓冲保存液中送检。有时,也采取病变组织碎屑,置载玻片上,供显微镜检查。

3.8 皮肤

病料直接采自病变部位,如病变皮肤的碎屑、未破裂水泡的水泡液、水泡皮等。

3.9 胎儿

将流产后的整个胎儿,用塑料薄膜、油布或数层不透水的油纸包紧,装入木箱内,立即送往实验室。

3.10 小家畜及家禽

将整个尸体包人不透水塑料薄膜、油纸或油布中,装入木箱内,送往实验室。

3.11 骨

需要完整的骨标本时,应将附着的肌肉和韧带等全部除在,表面撒上食盐,然后包入浸过5%石炭酸溶液的纱布中,装入不漏水的存器内送往实验室。

3.12 脑、脊髓

3.12.1 全脑、脊髓的采集

如采取脑、脊髓做病毒检查,可将脑、脊髓浸入30%甘油盐水液中或将整个头部割下,包人浸过消毒液的纱布中,置于不漏水的容器内送往实验室。

3.12.2 脑、脊髓液的采集

3.12.2.1 采样前的准备

采样使用特制的专用穿刺针,或用长的封闭针头(将针头稍磨钝,并配以合适的针芯);采样前,术部及用具均按常规消毒。

3.12.2.2 采样方法

3.12.2.2.1 颈椎穿刺法:穿刺点为环枢孔。将动物实施站立或横卧保定,使其头部向前下方屈曲,术部经剪毛消毒,穿刺针与皮肤面呈垂直缓慢刺入。将

针体刺入蛛网膜下腔,立即拔出针芯,脑脊髓液自动流出或点滴状流出,盛

人消毒容器内。

3.12.2.2.2 腰椎穿刺法:穿刺部位为腰荐孔。实施站立保定,术部剪毛消毒后,用专用的穿刺针刺入,当刺入蛛网膜下腔时,即有脑脊髓液滴状滴出或用消毒注射器抽取,盛入消毒容器内。

3.12.2.3 采样数量

大型动物颈部穿刺一次采集量35 mL~70mL,腰椎穿刺一次采集量15mL~30mL

3.13 液体病料

采集胆汁、脓、粘液或关节液等样品时,用烫烙法消毒采样部位,用灭菌吸管、毛细吸管或注射器经烫烙部位插入,吸取内部液体材料,然后将材料注入灭菌的试管中,塞好棉塞送检。也可用接种环经消毒的部位插入,提取病料直接接种在培养基上。

供显微镜检查的脓、血液及粘液抹片的制备方法:先将材料置玻片上,两用一灭菌玻棒均匀涂抹或另用一坡片推抹。组织块、致密结书及脓汁等亦可在两张玻片中间,然后沿水平面向两端推移。用组织块作触片时,持小镊将组织块的游离面在玻片上轻轻涂抹即可。

3.14 乳汁?

乳房先用消毒药水洗净(取乳者的手亦应事先消毒),并把乳房附近的毛刷湿,最初所挤的3~4把乳汁弃去,然后再采集10mL左右乳汁于灭菌试管中。进行血清学检验的乳汁不应冻结、加热或强烈震动。

3.15 精液

精液样品用人工方法采集,所采样品应包括“富精”部分,并避免加入防腐剂。

3.16 尿液的采集

在动物排尿时,用洁净的容器直接接取。也可使用塑料袋,固定在雌畜外阴部或雄畜的阴茎下接取尿液。采取尿液,宜早晨进行。

3.17 环境

为监测环境卫生或调查疾病,可从遗弃物、通风管、下水道、孵化厂或屠宰场采集有代表性样品。

4 送检样品的记录

送往实验室的样品应有一式三份的送检报告,一份随样品送实验室,一份随后寄去,另一份备案。样品记录至少应包括以下内容:

??? a)畜主的姓名和畜禽场的地址;

??? b)()场里饲养的动物品种及其数量;

??? c)被感染的动物种类;

??? d)首发病例和继发病例的日期及造成的损失;

??? e)感染动物在畜群中的分布情况;

??? f)死亡动物数、出现临床症状的动物数量及其年龄;

??? g)临床症状及其持续时间,包括口腔、眼睛和腿部的情况,产奶或产蛋的记录,死亡情况和时间,免疫和用药情况等;

??? h)饲养类型和标准,包括饲料种类;

??? i)送检样品清单和说明,包括病料的种类、保存方法等;

??? j)动物治疗史;

??? k)要求做何种试验;

??? 1)送检者的姓名、地址、邮编和电话;

??? m)送检日期。

5 样品的运送

??? 所采集的样品以最快最直接的途径送往实验室。如果样品能在采集后24h内送抵实验室,则可放在4℃左右的容器中运送。只有在24h内不能将样品送往实验室并不致影响检验结果的情况下,才可把样品冷冻,并以此状态运送。根据试验需要决定送往实验室的样品是否放在保存液中运送。

??? 要避免样品泄漏。装在试管或广口瓶中的病料密封后装在冰瓶中运送,防止试管和容器倾倒。如需寄送,则用带螺口的瓶子装样晶,并用胶带或石蜡封口。将装样品的并有识别标志的瓶子放到更大的具有坚实外壳的容器内,并垫上足够的缓冲材料。空运时,将其放到飞机的加压舱内。

制成的涂片、触片、玻片上注名号码,并另附说明。玻片两端用细木条分隔开,层层叠加,底层和最上一片,涂面向内,用细线包扎,再用纸包好,在保证不被压碎的条件下运送。

所有样品都要贴上详细标签。

附 录 A

(规范性附录)

待检样品保存液的配制

A.1 阿(Alserer)氏液

??? 葡萄糖???????????????????????????????????????????? 2.05g

??? 柠檬酸钠(Na3C6H5O7?2H2O)????????????????????????? 0.80g

??? 氯化钠(NaCl)??????????????????????????????????????? 0.42g

??? 蒸馏水(或无离子水)???????????????????????????? 加至100mL

??? 溶解后,以10%柠檬酸调至pH6.1分装后,70kPa10min灭菌,冷却后4℃保存备用。

A.2 30%甘油盐水缓冲液

??? 甘油????????????????????????? ???????????????????????????????30ml

氯化钠???????????????????????????????? ??????????????????????4.2g

磷酸二氢钾??????????????????? ???????????????????????????????1.0g

磷酸氢二钾??????????????????? ???????????????????????????????3.1g

0.02%酚红??????????????????? ??????????????????????????????1.5mL

蒸馏水????????????????????????????????????????????????? 100mL

加热溶化,校正pH值为7.6100kPal5min灭菌,冰箱保存备用。

A.3 肉汤(broth)

??? 牛肉膏??????????????????????????????????????????????? ??????3.5g

?蛋白胨????????????????????????????????????????????????????? 10g

??? 氯化钠?????????????????????????????????????????????????????? 5g

充分混合后,加热溶解,校正pH7.27.4,再用流通蒸气加热30rain,用滤纸过滤,获蒿黄色透明液体,分装于试管或烧瓶中,以100kPa20min灭菌。保存于冰箱中备用。

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